Полимеразна верижна реакция (PCR)

› Въведение

› В кои случаи се препоръчва провеждането на изследването?

› Необходима ли е предварителна подготовка?

› Метод на провеждане на изследването:

› Какво ще усещате по време на изследването?

› Има ли рискове от провеждането на изследването?  

› Резултати от проведеното изследване:

› Кога не трябва да провеждате изследването?

Въведение

Полимеразна верижна реакция (Polymerase chain reaction, PCR) е широко използван лабораторен метод, използван за създаване на много голям брой (милиони до милиарди) копия на избрани къси участъци от конкретна ДНК (таргетна ДНК), взета от много малко количество проба.

Този процес на намножаване се нарича "амплифициране на ДНК" и позволява откриване или количествен анализ на определени гени чрез получаване на голям брой копия на таргетния ДНК сегмент.

PCR е разработен през 1984 година от американския биохимик Kary Mullis и оттогава е намерил много разнообразно и широко приложение - от анализ на древни проби ДНК с цел изследване на човешката еволюция до криминалистични експертизи.
За откритието си Mullis получава Нобелова награда през 1993 година.

Методът е високочувствителен и в медицината може да се използва за откриване на бактериална, вирусна или протозойна ДНК в малки количества проби от кръв, секрет или тъкан на пациента.

Високата чувствителност на PCR позволява откриване на вируси скоро след инфекцията и дори преди клиничното начало на заболяването.

Варианти на класическата PCR са:

PCR в реално време (Real-time PCR)/Количествен PCR (Quantitative PCR, qPCR)

PCR в реално време, известен и като количествен PCR (qPCR), е подобен на стандартния PCR метод, с изключение на това, че данните се получават, докато протича процесът на амплификация (тоест в реално време), а не в края на процеса, което съкращава времето за получаване на резултатите.

Освен същите предимства като PCR, допълнително предимство на този метод е количественото измерване ДНК в изследваната проба.

Обратно транскриптазна полимеразна верижна реакция (Reverse Transcriptase PCR, RT–PCR)

Този метод използва полимеразна верижна реакция за амплифициране на РНК.

РНК е едноверижна молекула и трябва да бъде превърната в ДНК последователност, преди да може да бъде амплифицирана.

Получаването на нова верига ДНК, която е комплементарна (съответна) на РНК, се постига чрез праймер и ензима обратна транскриптаза.
Праймерът се свързва с едноверижната РНК, а ензимът обратна транскриптаза копира РНК веригата, за да се получи едноверижна ДНК, която след това се копира, за да се получи двуверижна ДНК молекула.

Двойноверижната молекула вече може да бъде амплифицирана чрез PCR.

Лабораторни тестове, при които се прилага RT-PCR, са например изследване за:

• ХИВ вирусен товар
• вирус на хепатит С (HCV)
• морбили 
• паротит

В кои случаи се препоръчва провеждането на изследването?

Приложенията на PCR са разнообразни и включват:

• Поставяне на диагноза - това е особено полезно, когато болестотворните агенти се изолират трудно върху хранителна среда или са малък брой в проба
• Преди приложение на антибиотик или антипротозойно лекарство за потвърждаване на активна инфекция
• За определяне на вида инфекциозния агент, което дава възможност да се избере подходящ клас медикамент
• След завършване на лечението, за да се потвърди излекуване на инфекцията
• Бъдещите родители могат да бъдат тествани за генетично носителство на дадено заболяване
• PCR анализът също е от съществено значение за предимплантационна генетична диагноза, където отделни клетки на развиващ се ембрион се тестват за мутации
• Пренатално изследване - ДНК проби могат да бъдат получени чрез амниоцентеза, биопсия на хорионни въси или в редки случаи чрез анализ на фетални (на плода) клетки, циркулиращи в кръвта на майката
• Тъканно типизиране - жизненоважен тест при трансплантацията на органи
• Ранна диагностика на злокачествени заболявания като левкемия и лимфоми
• Много форми на рак включват промени в онкогените, като PCR дава възможност за изследване на тези мутации, което позволява да се направи индивидуална терапевтична схема за всеки пациент
• Откриване на наследствени мутации в гени, които причиняват заболявания като рак на гърдата и дебелото черво

Изображение: www.freepik.com

• Бърза, ранна и специфична диагностика на инфекциозни заболявания, причинени от бактерии или вируси, включително:
  • вирусен геном на SARS-CoV-2 (COVID-19)
  • ХИВ вирус
  • аденовируси
  • вирус на птичия грип
  • бактерии от рода Brucella (бруцелоза)
  • хламидия
  • Епщайн-Бар вирус
  • човешки папилома вирус (HPV)
  • идентифициране на некултивиращи се или бавно растящи микроорганизми - например причинителя на туберкулозата (Mycobacterium tuberculosis)
  • Bordetella pertussis (коклюш)
  • Toxoplasma gondii (токсоплазмоза)
  • Зика вирус и много други причинители
• Приложение в криминалистиката:
  • изследване на доказателства от местопрестъпление
  • изследване на пръстови отпечатъци

• Потвърждаване на бащинство
  

Необходима ли е предварителна подготовка

Полимеразната верижна реакция не изисква специфична предварителна подготовка.

В зависимост от това, откъде ще се взема проба за изследване, може да се наложи предварително пациентът да се подготви за самата процедура на вземане на проба, като това ще бъде уточнено от лекаря.

Метод на провеждане на изследването

PCR се извършва в поредица от стъпки (цикли) в апарат, наречен термоциклер (амплификатор). Този инструмент увеличава и намалява температурата на пробата на определени интервали (цикли) от време.

Първата стъпка/цикъл на PCR е да се раздели двойната верига на ДНК на две единични вериги чрез повишаване на температурата на пробата, която съдържа търсената специфична ДНК.
Този етап се означава като "денатуриране на ДНК''.

След като двете вериги на ДНК се разделят, пробата се охлажда и се добавят праймери, които се прикрепват към съответните им участъци от едноверижната ДНК матрица.
Праймерите (primers) представляват къси изкуствено синтезирани нуклеотидни последователности, които разпознават и се свързват към участъка от ДНК, който трябва да бъде амплифициран.

След като праймерите се прикрепят към всяка от двете разделени вериги на ДНК, ДНК ензим (най-често Taq полимераза) след това копира последователността на всяка верига, като по този начин се синтезират две нови двойноверижни копия на изходната ДНК.

След това температурата се повишава отново, всяка от двете двойни вериги се разделя, за да се получат 4 единични вериги.
След последващо охлаждане праймерите и полимеразата действат, за да се образуват четири двойни спирали. Четирите спирали стават 8 в следващия цикъл, 8 стават на 16 и т.н. - амплификация.

В рамките на 30 до 40 цикъла могат да бъдат синтезирани до милиард копия от оригиналния ДНК участък, които след това са достъпни за използване в различни молекулярни диагностични тестове.

Този процес е автоматизиран, така че милиард копия от оригиналната ДНК могат да бъдат получени в рамките на няколко часа.

Чрез PCR не се откриват или амплифицират антитела или антигени, а само ДНК или РНК, тоест търсеният причинител трябва да бъде във взетата пробата, за да се открие неговия генетичен материал.

Използването на кортикостероиди в повечето случаи ще увеличи броя на инфекциозните агенти в кръвта. Следователно прилагането на кортикостероиди, особено в имуносупресивни дози, може да увеличи вероятността за откриването на инфекциозен агент чрез PCR.

Какво ще усещате по време на изследването

Самият PCR метод се провежда в лабораторни условия с взета проба от пациента, поради което може да има специфични усещания при вземането на самия материал за изследване:

При вземане на кръв за изследване не би трябвало да се установяват някакви значителни негативни ефекти след приключване на процедурата.
Пациентът може да усети пристягането на турникета, както и леко убождане при вкарването на иглата във вената. По време на самото вземане на кръв няма да усещате нищо.

При вземане на урина за изследване няма неприятни усещания от страна на пациента.

При вземането на пробата за изследване от горните дихателни пътища пациентът може да почувства дискомфорт, да получи гадене или кашлица.
Тези симптоми са временни и бързо отшумяват.

Материал за изследване може да се вземе от много други различни тъкани, структури, органи и секрети, което води до специфични възприятия в зависимост от мястото, откъдето ще се вземе проба за изследване.

Има ли рискове от провеждането на изследването

Самата полимеразна верижната реакция не крие рискове за пациента.

Евентуални проблеми може да възникнат при вземането на пробите за изследване.

www.emedicinehealth.com

Резултати от проведеното изследване:

Резултатите от PCR не трябва да се тълкуват самостоятелно и да се постави диагноза само върху данните от този тест.

Резултатите от изследването обикновено са готови в рамките на 24-36 часа.

Нормални стойности:

Няма наличие на ДНК или РНК на търсения инфекциозен агент в изследваната проба - отрицателен PCR.

Ако не е установена друга етиология и все още има клинични данни за инфекция, трябва да се вземат и изследват допълнителни проби.

Въпреки че е много чувствителен тест, единичен отрицателен PCR тест не трябва да се използва за отхвърляне на диагноза при пациенти, при които има изразени симптоми.

За потвърждаване на излекувана инфекция, са необходими няколко последователни отрицателни PCR теста.

Отклонения от нормата:

Положителен резултат, който показва наличието на ДНК или РНК на даден инфекциозен причинител и потвърждава инфекцията.

Кога не трябва да провеждате изследването

За самото лабораторно провеждане на полимеразна верижна реакция няма контраиндикации.

Недостатъчно количество на взетата проба може да не позволи провеждане на изследването.

Фактори, които могат да доведе до подвеждащи или неясни резултати, включват:

• Дори минимално замърсяване на взетата проба с друг генетичен материал
• Проба, взета преди появата на симптомите или късно в хода на заболяването
• Наличие на инхибитори на амплификация в пробата
• Лабораторна грешка при провеждане на изследването
• Пробите от околната среда, които съдържат хумусна киселина, могат да инхибират амплификацията на PCR и да доведат до неточни резултати
• Недоброто съхранение или транспортиране

Противопоказания са налице при вземането на проби от горни дихателни пътища за изследване. Вземането на проба от назофаринкса (носоглътката) не трябва да се извършва, ако:

• пациентът е претърпял наскоро травма на носа/лицето или операция
• е налице значителна девиация (отклоняване, изкривяване) на носната преграда
• хронична обструкция (запушване) на носните проходи
• тежка коагулопатия (нарушение в кръвосъсирването)

В тези случаи проба за изследване може да се вземе от орофаринкса.

Изследването не се препоръчва и ако е правен PCR на проба от назален секрет през последните 7 дни, ако е изолиран MRSA от назална култура през последните 7 дни, а също и ако пациентът е с муковисцидоза.

Заглавно изображение: www.freepik.com