Култивиране на бактериите

Култивирането на бактериите представлява процес, при който даден микробен вид се развива и размножава в изкуствено създадени и подходящи за него условия, с цел изучаване на неговите морфологични и физиологични особености, поставяне на микробиологична диагноза и определяне на антибиотичната му чувствителност. Култивирането се извършва върху хранителни среди, които са изкуствено създадени субстрати, съставени от необходимите източници на ограногенни (C, N, H, O, P) и други елементи, както и на редица растежни фактори. Химичният състав, Ph, хранителните вещества, температурата и аерирането в тези среди създават оптимални условия за размножаването на дадения микробен вид и осигуряват подходящи елементи в метаболитно достъпна форма.

Сухо вещество на микроорганизмите е представено предимно органични вещества (белтъци, въглехидрати, липиди и нуклеинови киселини), съдържащи елементите въглерод, водород, азот, кислород, фосфор и сяра. Друга важна съставка на сухото вещество са неорганични елементи като калий, натрий, желязо, магнезий, калций и хлор, които са необходими за улесняване на ензимната катализа и за поддържане химични градиенти през клетъчната мембрана. За размножаването на микробите са необходими всички елементи, характерни за неговата органична материя и всички йони, участващи в производството енергията и осъществяването на ензимната активност. Важно условие за култивирането им е и наличието на източник на енергия за синтеза на нови макромолекули.

Отделните микроорганизми се различават значително в зависимост от хранителните им нужди и използваните от тях източници на метаболитна енергия. Трите основни механизма за генериране на метаболитна енергия при бактериите са ферментацията, дишането и фотосинтезата. При култивирането на бактериите се използва най-малко един от тези механизми.

Характеристика на хранителните среди, използвани за култивиране на бактериите

1. Важен елемент в изготвянето на хранителните среди е азотът (N). Той е основен компонент на протеините, нуклеиновите киселини и други съединения, представляващи приблизително 5% от сухата маса на типична бактериална клетка. Източник на този елемент са органични съединения, които се добиват от месо или хидролизирани белтъчни продукти (пептони). В средите често се добавят кръв, серуми, асцитна течност, яйчен белтък и др. За някои болестотворни бактерии източник на азот са единствено аминокиселините, а при други простите аминови съединения. Въпреки че азотът може да бъде доставен в хранителните среди под редица форми и микроорганизмите се различават в способността си да приемат азот от разнообразни източници, крайният продукт на всички тях е най-редуцираната форма на елемента - амоняк (NH₃). При наличие на амоняк, той се приема от повечето бактерии чрез трансмембранни канали като разтворен газообразен NH₃, а не под формата на амониев йон (NH⁴⁺).

2. Източник на въглеродни атоми, необходими за синтезата на органични макромолекули от бактериите, са захари, поливалентни алкохоли, кисели и др. Глюкозата, например, може да подпомогне ферментативния или аеробен растеж на много микроорганизми. Важно е субстратите, подпомагащи растеж, да бъдат в такава концентрация, която е подходящи за култивирания микробен щам. Концентрации, които подпомагат растежа на един микроорганизъм, могат да възпрепятстват растежа на други.

3. Сярата (S), подобно на азота, е важен компонент на много органични клетъчни вещества. Тя е част от структурата на някои коензими и се намира в страничните вериги на протеини, съдържащи аминокиселините цистеин и метионин. Сярата, в нейната елементарната форма, не може да се използва от растенията или животните. За разлика от тях, някои автотрофни бактерии могат да окислят сяра до сулфат (SO₄^2-). Повечето микроорганизми могат да използват сулфат като източник на сяра, като го редуцират до нивото на сероводород (H₂S). Някои микроорганизми могат да асимилират сероводорода директно от хранителната среда, но това съединение може да бъде токсично за много други.

4. Фосфорът (P) под формата на фосфатен анион (PO₄^3-) е компонент на аденозинтрифосфата (АТР), нуклеиновите киселини и коензими като НАД, НАДН и флавоноидите. Множество метаболити, липиди (фосфолипиди, липид А), компоненти на клетъчните стени (тейхоева киселина), някои капсулни полизахариди и някои протеини са фосфорилирани. Фосфорът се поема от бактериалните клетки единствено като свободна неорганична форма.

5. Редица минерални вещества са необходими за осъществяване на ензимната функция в микробната клетка и тяхното съдържание в хранителните среди е от съществено значение за култивиране на бактериите. Магнезиевите (Mg²⁺) и железните (Fe²⁺) йони участват в синтезата на порфиринови деривати: магнезият в хлорофилната молекула и желязо като част от коензими на цитохромите и пероксидазите. Mg²⁺ и K⁺ са от съществено значение реализиране функцията и целостта на рибозомите. Калциевите йони (Ca²⁺) са важен компонент на клетъчните стени на Грам-положителните бактерии, но също така е необходим и за Грам-отрицателни видове. При изготвяне на хранителни среди за култивиране на повечето микроорганизми е необходимо да се осигурят източници на калий, магнезий, калций и желязо, обикновено под формата на техните йони (К⁺, Mg²⁺, Са²⁺ и Fe²⁺). Много други минерали (напр. Mn²⁺, Mo²⁺, Co²⁺, Cu²⁺ и Zn²⁺) също са необходими за жизнената дейност на прокариотната клетка. Те могат да бъдат осигурени с питейна вода или като замърсители на други съставки на хранителната среда.

Важна роял в състава на хранителните среди е наличието на натриев хлорид (NaCl) в концентрация от порядъка на 0,5-0,8%. При тази концентрация се осигурява изотонична среда (нормално осмотично налягане), в която нормално се осъществява транспорта на хранителни вещества и йони. Някой патогенни бактерии могат да се размножават и при по-висока концентрация на натриев хлорид - 6-14%. Такива са стафилококите, които растат в среди с 8% NaCl.

6. Други важни характеристики на хранителните среди са оптимална киселинност (pH), консистенция (твърди, течни), стерилност, и пр. pH на средата, в която се развиват повечето бактерии, е в границите 6,8-8,0, като за оптимално се приема pH около 7,2-7,4. Определени бактерии изискват за култивирането си леко кисела (туберкулозни бактерии - pH 6,8) или алкална среда (холерни вибриони - pH 8,0).

Видове хранителни среди за култивиране на бактериите

Според състава си хранителните среди се разделят на:

• обикновени хранителни среди - месно-пептонен бульон (МПБ), месно-пептонен агар (МПА), месно-пептонен желатин (МПЖ);
• сложни (специални) хранителни среди - получават се от обикновените хранителни среди, към които допълнително се прибавят кръв, животински или човешки серум, глюкоза, яйчен белтък и др.

Най-често в микробиологичната диагностика се използват специалните хранителни среди, които служат за изолиране и идентифициране на болестотворни микроорганизми при изследване на заболели, в чиито секрети има смесена микрофлора. В зависимост от състава си и своето практическо предназначение се разделят на:

• елективни хранителни среди - подпомагат развитието на търсения бактерии, но не възпрепятстват растежа на останалите микробни видове (напр. среда на Льофлер за дифтерии);
• селективни хранителни среди - благоприятстват единствено растежа на търсения бактериален вид, като потискат напълно или частично на останалите в изследвания материал (напр. среди за туберкулозни бактерии);
• диференциращи хранителни среди - служат предимно за култивиране на чревни бактерии и в зависимост от промяната на вида и цвета на развиващите се върху тях колонии, позволяват да се съди за биохимичната активност на болестотворните бактерии (напр. хранителни среди на Ендо, Гаснер, Левин).

При различните методи на култивиране на бактериите трябва да се спазват и редица изисквания, свързани с условията на външната среда - температура, аерация, наличие или липса на кислород и др. Повечето от патогенните бактерии са мезофилни и се развиват добре при температури от 30-37 C, но някои от тях могат да виреят при температури в границите на 4-45 C. Така например Yersinia pestis (чумен бактерии), Yersinia enterocolica, Listeria monocytogenes и др. могат да се размножават и при 4-5 C.