Имунна хистохимия

Имунната хистохимия съчетава анатомични, имунологични и биохимични техники за идентифициране на отделни тъканни компоненти чрез взаимодействие на прицелни антигени със специфични антитела, маркирани с видим етикет. Тя дава възможност да се визуализира разпределението и локализацията на специфични клетъчни компоненти в клетките. Въпреки че има многобройни подходи в методологията на имунна хистохимия, всички етапи са разделени на две групи: подготовка и етикетиране на пробите.

Имунната хистохимия е мощна микроскопична техника за визуализиране на клетъчни компоненти, например протеини или други макромолекули в тъканни проби. Силата й е интуитивната визуална продукция, която разкрива съществуването и локализирането на целевия протеин в контекста на различни типове клетки, биологични състояния и/или субклетъчна локализация в рамките на сложните тъкани.

Техниката на имунна хистохимия е изобретена през 40-те години на миналия век (Coons, Creech и Jones, 1941 година) и се използва рутинно като важен инструмент в здравеопазването и патологията, например за диагностични цели или за стратифициране на пациентите за оптимизирани режими на лечение. Също така се използва широко в научните изследвания, където молекулите се анализират, за да се изследват техните роли както в здрави, така и в болни клетки и тъкани на молекулно, клетъчно или тъканно ниво. Има много различни начини за извършване на визуализация на мишени в тъкани, използващи методи, базирани имунохистохимия и съществуват множество протоколи за различни приложения и тестове. Въпреки че имунна хистохимия обикновено е солиден и установен метод, новите тестове често се нуждаят от внимателна оптимизация в зависимост от тъканта или от свойствата на целевия протеин, свързващата молекула и/или репортерната система. Многогодишното техническо развитие и изключително голямата наличност за специфични молекули на свързване значително подобряват полезността и областите на приложение на изследването.

Тъканта играе централна роля при изследването и е важно тя да бъде обработена така, че да бъдат запазени епитопите и подходящата морфология. Най-често срещаната обработка за имунна хистохимия е да се подготвят тъкани блокове, фиксирани с формалин, съдържащи парафин. Целта на фиксирането на формалин е да произведе химично кръстосано свързване на протеини в тъканта. Това прекратява всички клетъчни процеси и замръзва клетъчните компоненти на мястото и в конформацията, в която са в момента на фиксирането, и също така предотвратява разграждането. След адекватно фиксиране, тъканта се обработва допълнително и в крайна сметка се вгражда в парафинови блокове, които след това се разделят на тънки резени (обикновено 4-10 μm), като се използва микротом. Секциите се прехвърлят на стъклени пързалки и се оставят да се залепят преди по-нататъшна обработка.

Други методи за фиксиране, освен формалин понякога се използват. Те включват други видове алдехиди или различни алкохолни разтвори. Най-добрият избор на фиксатор зависи в голяма степен от анализа. Често срещана алтернатива на парафин е да се подготвят замразени тъканни проби. В този случай, тъканта се закрепва в криозащитна среда и се замразява и фиксирането се извършва след разрязване. Замразените тъкани се разделят на кристатици и имат предимството на кратки времена на обработка и по-добро запазване на чувствителните епитопи, но често могат да бъдат по-ниски от тъканите на парафин по отношение на запазване на хистологичната морфология.

Извличането на антиген (епитоп) с фиксиращи агенти като формалин или прекалено дълго време, прекарано във фиксираща среда, представлява покриването на епитопи, което може да възпрепятства свързването на първичното антитяло с неговата цел. Особено при парафинови проби, често има нужда от връщане на част от химичното омрежване и "извличане" на епитопите, преди да се пристъпи към действителния имунохистохимичен анализ. Съществуват няколко метода за извличане на антигени, а основните стратегии включват третиране на тъканния плъзгач с топлина, храносмилателни ензими, детергенти или комбинации от тях. Най- честият метод за извличане на антигени в проби от парафин е да се накапват под налягане тъканните пързалки в кисел цитратен буфер за около 15-20 минути.

Качеството и специфичността на свързващата молекула е от решаващо значение за всяка техника, базирана на имунна хистохимия, и изборът на свързващо вещество може директно да повлияе върху резултата, надеждността и евентуално и интерпретацията на анализа. Антителата са далеч най-разпространеният тип свързваща молекула и макар че повечето антитела са в състояние да открият адекватно правилната молекула, представляваща интерес, те също могат да се различават значително в тяхната специфичност за планираната цел. Поради това антитела с висока специфичност са по-надеждни при интерпретирането на свързването "на целта", тъй като те произвеждат малко или никакво "не прицелно" свързване или "фон". Антитела, които са по- малко специфични, могат да генерират по-нецелево свързване и полученият фон вероятно ще пречи на правилната интерпретация на истинските сигнали по целта. Има два основни типа антитела:

• поликлонални антитела, които са хетерогенна смес от антитела, които се свързват с различни епитопи върху целевите и моноклонални антитела, които всички се свързват със същия епитоп. Поликлоналните антитела често са много мощни поради способността си да откриват и свързват множество епитопи на една и съща цел. Обаче епитопите, които те свързват, често са слабо дефинирани и с множество и вариращи специфики идва увеличената вероятност за извънсъединителни обвързващи събития и фонов шум. Въпреки това, ефикасността на поликлоналните антитела може да бъде изгодна, тъй като концентрацията на свързващи събития около молекулата на целта обикновено надвишава потенциалния фонов шум. Недостатък е, че поликлоналните антитела обикновено са ограничени ресурси, тъй като те са получени от животински серуми.
• моноклоналните антитела, за разлика от тях, имат повече приемственост, тъй като те могат да бъдат произведени в хибридомни клетъчни линии. Моноклоналните антитела също често са добре дефинирани по отношение на епитопно свързване, но все пак могат да генерират резултати, които трудно могат да бъдат интерпретирани, ако спецификата е ниска или ако целевият епитоп присъства в ниско изобилие.

Необходима е внимателна оптимизация и титруване на концентрацията на антитела за всеки анализ, тъй като резултатът зависи не само от специфичността и афинитета на антитялото към целта, но също и от концентрацията и наличието на прицелни и потенциални извън целеви епитопи, присъстващи в пробата. Добавянето на твърде много антитела към пробата ще увеличи броя на евентуалните свързващи събития с нисък афинитет, когато епитопът или епитопите в прицел са наситени със свързващи вещества. Чрез понижаване на концентрацията на антитялото, външните прицелни свързващи събития стават рядко, тъй като те обикновено имат по-нисък афинитет, отколкото при събития, свързани с прицел. Рискът, когато се опитва да намали фона при използване на ниско афинитетно антитяло, е, че сигналите по цел са съпътстващо отслабени до точката на осигуряване на фалшив отрицателен резултат.

Други типове свързващи молекули, които понякога се използват в техники, основани на имунохистохимия, включват афибропами, пептиди, фрагменти на антитела или други малки молекули.

Целта на извършването на изследването е да се получи визуално представяне на мястото, където целта може да бъде намерена в експерименталната тъкан и за предпочитане също да получи информация за модела на експресиране на мишената сред хетерогенните клетъчни популации и/или субцелуларни локализации. За проби от тъкани от парафин най-честият метод за откриване е да се използват ензимни реакции, за да се получи цветна утайка в мястото на свързване на антитялото. Вторичните антитела след това носят ензими, които са способни да конвертират хромогени като 3,3 'диаминобензидин или 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в кафяви или синкави утайки, които се отлагат в тъканта на мястото на реакцията. Хромогенните петна се наблюдават при светлинна микроскопия и обикновено са много стабилни за дълги периоди от време, което е полезно, ако експериментът трябва да бъде архивиран или прегледан по-късно.

За замразени тъканни срезове е по-често да се използват вторични антитела, свързани с флуорофори, които излъчват специфичен цвят (обикновено зелен, червен или син), когато са възбудени от правилните дължини на вълната на светлината. Освен това флуорофорите обикновено не са стабилни за дълги периоди от време. Обаче, ползата от използването на флуорофори е, че те осигуряват лесен метод за провеждане на експерименти с двойно маркиране, където няколко антитела към множество мишени се анализират в една и съща проба. Вторичните антитела трябва да бъдат насочени към различни първични антитела и също така да бъдат свързани с различни флуорофори. Различните вторични антитела след това се наблюдават отделно, като ги възбуждат последователно с различни дължини на вълната на светлината. Тези различни резултати от възбуждането се запазват като отделни изображения (или цветни канали) и могат по-късно да бъдат насложени, за да се извлекат ко-локализации на протеини и така нататък.

Използването на репортер-носещи вторични антитела за откриване сам по себе си е стъпка на амплификация, тъй като няколко вторични антитела са способни да се свързват с едно-единствено първично антитяло, но понякога са необходими допълнителни етапи на амплификация за увеличаване на сигнала и чувствителността на експеримента. В такива случаи вторичното антитяло може вместо това да носи "молекули на линкер", например биотинови полимери, които са в състояние да набират по-голям брой репортерни молекули в следващите етапи. Тази стратегия за усилване на сигналите е полезна както за методите за ензимно и флуоресцентно откриване.

Имунохистохимичното оцветяване, използващо хромогени, често благоприятства прилагането на контрастно покритие, което увеличава контраста и улеснява наблюдението на хистологичните особености. Най-често срещаният тип контрастиращ материал, използван за парафинови проби, е хематоксилин, който оцветява клетъчната цитоплазма с бледо синкав цвят и оцветява клетъчните ядра в по-тъмен синкав нюанс. Флуоресцентните оцветявания обикновено не се контрастират с хематоксилин, тъй като методът за откриване не се основава на светлинна микроскопия. Вместо това най-честият начин за получаване на контрастиране за флуоресценция е да се маркират клетъчните ядра чрез добавяне на флуоресцентни багрила, които свързват нуклеинови киселини. След действителната имунохистохимична реакция, оставащите стъпки са само за покриване и запечатване на пробата за защита и дългосрочно съхранение.

Имунната хистохимия се използва широко както в изследванията, така и в клиничната практика. В клиничната практика се използва предимно в рамките на патологията, за да помогне на лекарите да оценяват пробите от тъкани по отношение на заболявания, да определят диагнози и да определят молекулния подтип на различните видове рак. Специфичен пример, при който имунна хистохимия се използва диагностично, е когато патолозите са представени с метастатична туморна проба и тъканният произход на първичния тумор е неизвестен. В тези случаи патолозите използват панел от различни антитела, насочени към специфични за тъканите протеини, като простатен специфичен антиген за рак на простатата или естрогенния рецептор за гинекологични ракови заболявания или цитокератин 20 за стомашно-чревни ракови заболявания. След като се направи широка класификация, се използват допълнителни специфични за тъканите антитела, за да се установи още повече произходът на първичния тумор. Тази информация е полезна при избора на най-добрата или най-подходящата стратегия за лекарствена терапия и/или за намиране на първичния тумор за лъчева терапия и/или хирургия.