Реакции с белязани антитела

Антителата са протеини, произведени и секретирани от В-лимфоцитите. Терминът антитяло се отнася до неговата функция, която е да се свързва с антигените.

Антителата са Y-образни молекули, състоящи се от две тежки вериги (Н-вериги) и две леки вериги (L-вериги).
Антитялото се свързва с проеделен антиген, за да инициира имунен отговор. Някои антитела се свързват към специфични антигени. Тази реакция е в основата на тестовете за идентификация. Такава реакция може да се разглежда само под микроскоп с маркирано антитяло. Маркерът може да бъде ензим, флуорофор или колоидно злато. Ензимът може да предизвика хромогенна реакция, което прави възможно идентифицирането. Флуоресцентният микроскоп се използва за преглед на флуорофорния етикет. Електронният микроскоп се използва за преглед на колоидното злато. Маркирането на антитела е важна молекулярно-биологична техника.

Антителата се използват широко в имуноанализите за откриване и количествено определяне на антигените.
Флуоресценцията е резултат от процес, който се случва, когато определени молекули (обикновено полиароматни въглеводороди или хетероцикли), наречени флуорофори, флуорохроми или флуоресцентни багрила, абсорбират светлината. Абсорбцията на светлината от тези молекули повишава нивото на енергията им до кратко възбудено състояние. Тъй като те се разлагат от това възбудено състояние, те излъчват флуоресцентна светлина.

Маркирането на антитела може да се извърши по два метода: директно и непряко етикетиране. Както подсказва името, директното етикетиране използва едно основно антитяло за процеса на етикетиране. Това антитяло е ковалентно свързано към маркираща молекула. След това първичното антитяло се добавя към антигенния комплекс и се инкубира. Първичното антитяло се свързва със специфичния антиген, докато излишното антитяло се отмива. Свързването на етикета към първичното антитяло може да доведе до малка загуба на специфичност. Непрякото етикетиране използва две антитела. Първичното антитяло се използва за идентифициране и откриване. Вторичното антитяло се използва за маркиране и усилване на етикета.

Имуноглобулините могат да бъдат маркирани с различни вещества за откриване. Когато се използва търговски комплект за маркиране на антитела, трябва да се внимава да не се загуби активността на антитялото. Обикновено се използват два вида методи за маркиране в зависимост от това коя част от антитялото е маркирана. Първият е да се маркират аминогрупите (NH2 групи) на антитялото (тип NH2), а второто да се маркират сулфхедрилните групи (SH групи). Всеки метод има предимства и недостатъци. Методите тип NH2 са подходящи за етикети с ниско молекулно тегло, а тип SH с високо молекулно тегло. Сред четирите аминокиселини с аминогрупи със странична верига (глутамин, лизин, аргинин, аспарагин) може да бъде маркиран само лизин. В допълнение, N-крайната амино група може да бъде маркирана. По този начин има много места, които могат да бъдат обозначени. Антителата се маркират чрез инкубиране с активно естерно производно на флуорофор или ензим. Редица активни естерни производни на флуорофори и ензими са търговски достъпни.

Общи типове маркери:

• Флуоресцентни;
• Ензимни;
• Биотин;
• Магнитни перли, агарозни перли, магнитни агарозни перли;
• Колоидно злато.

Флуоресцентно белязаните антитела се използват за поточна цитометрия и имунофлуоресцентно оцветяване. За двойно или тройно оцветяване могат да се използват множество антитела с различни флуоресцентни етикети.

Флуоресценцията е свойството да излъчва електромагнитно излъчване под формата на светлина в резултат и само по време на абсорбцията на светлина от друг източник. Много молекули флуоресцират, но само няколко се използват рутинно в имунохистохимията. Те се използват поради интензивността на тяхната флуоресценция и способността да се различи флуоресценцията от фоновата автофлуоресценция на пробата, възникваща от възбуждане на ендогенни молекули като флавинови съединения, NADH, еластин, фибронектин, хемоглобин или хлорофил. Точният източник на флуоресцентна светлина е едно от най-големите предимства на тази техника за етикетиране, тъй като осигурява по-добра резолюция от системите, които зависят от пречупената светлина за изображения. Обикновено дължината на вълната на светлината, необходима за възбуждане на флуорофора, е по-голяма и с по-голяма интензивност от дължината на вълната на излъчваната светлина. Разделянето на максимума на дължината на вълната на възбуждане и максимума на дължината на вълната на излъчване се нарича стоксово изместване и засяга както яркостта, така и откриването на флуорофора. Източникът на светлина, филтърът за възбуждане, дихроичното огледало, емисионният филтър и обективът допринасят за интензивността на флуоресцентното изображение.

Ензим-белязани антитела се използват за ELISA, Western blotting и имунооцветяване. Маркираните антитела се откриват чрез реакция със субстрат, който излъчва светлина или променя цвета си.
Ензимните етикети могат да се видят при светлинна микроскопия. Ензимните етикети се използват за скрининг. Ензимните етикети обикновено се добавят към вторичното антитяло. Няколко примера на ензимни етикети включват HRP (Horse Radish Peroxidase) и телешки чревен алкален фосфат (АР). Глюкозооксидаза и Ь-галактозидаза рядко се използват. По време на реакцията пероксидазите превръщат фенолите и амините в неразтворим пигмент в присъствието на водороден пероксид. Реакцията на алкалните фосфати се идентифицира чрез свързващ механизъм. Това явление е насочено към освобождаване на хромогенен пигмент при хидролиза. Той се основава или на редукцията на тетразолови соли, или на производството на оцветени диазосъединения.

Биотин-белязани антитела се използват при поточната цитометрия, имунофлуоресцентното оцветяване и имунохистохимичното оцветяване. Биотин-белязани антитела се откриват чрез реакция с багрило, ензим или флуорофор авидин.

Злато-белязани антитела се използват в имуноелектронната микроскопия. Този метод е силно чувствителен и сигналът не избледнява, както при флуоресцентното и ензимно маркиране.