Витално оцветяване на тъканите

Виталното оцветяване на тъканите означава оцветяване, което може да се приложи върху живи клетки, без да се убиват. Стандартните методи за обработка на материята за микроскопско изучаване на органите и тъканите имат съществен недостатък - обектът е винаги в статично състояние, зафиксиран в момента на определена функционална активност или след прекъсване на жизнените процеси. Естествен е стремежът да се търсят методи, позволяващи наблюдение на живи органи и тъкани. Такава възможност се открива с въвеждането в практиката на метода за витално оцветяване на тъканите. Този метод е широко разпространен в експерименталната патология, но в последните години много успешно се прилага и в клиничната дерматология, гастроентерология, хепатология и други.

Оцветяването in vivo (наричано също жизнено оцветяване или интравитално оцветяване) е процесът на оцветяване на живи тъкани. Чрез причиняването на определени клетки или структури да възприемат контрастен цвят (цветове), тяхната форма (морфология) или позицията в клетка или тъкан могат лесно да се видят и проучат. Обичайната цел е да се разкрият цитологични подробности, които иначе не биха били очевидни. Обаче, оцветяването може също така да разкрие къде се извършват определени химични вещества или специфични химични реакции в клетките или тъканите.

Като се познават особеностите за разпределянето в тъканните компоненти на един или няколко оцветители при нормална функция на организма, могат да се определят различните отклонения, настъпващи при едно или друго патологично състояние. Значителна помощ оказват виталните оцветители за ембрионалните изследвания при изучаване на развитието, тъй като успешно може да се проведе наблюдение върху миграцията на оцветените клетки. Подобно на обикновените хистологични оцветители, всички вещества за витално оцветяване на тъканите се разделят на:

• основни - те се поемат от почти всички клетки, но особено добре от клетки и структури, богати на липиди
• кисели - те оцветяват само някои видове клетки и на първо място клетки, притежаващи висока фагоцитарна активност. Тези клетки играят важна роля при имунните реакции на организма. Към тези оцветители се отнасят трипаново синьо, туш, литиев кармин, синьо на Еванс и акридин-оранж.
• неутрални

Съществуват различни начини на прилагане на виталните оцветители. При лабораторни животни се въвеждат чрез венозни, коремни и подкожни инжекции, при което скоростта на оптималната цветна реакция зависи от начина на въвеждане. Обикновено оцветителите се разтварят в дестилирана вода или изотоничен разтвор на натриев хлорид. Обаче най-добър разтворител се явява кръвния серум на съответното животно.

Усвояване на техниката на витално оцветяване на тъканите се осъществява най-добре при визуализиране съединителната тъкан на бели плъхове или мишки с трипаново синьо. Тя се състои от четири етапа:

• Приготвяне на разтвора - 1 грам трипаново синьо се разтваря в 100 милилитра изотоничен разтвор на натриев хлорид. Годността на разтвора при съхранение на хладилно място е 3-4 седмици. Преди употреба разтворът се филтрира, стерилизира и се оставя да изстине до температура 25-35 градуса. Едновременно се стерилизират двукубикови спринцовки и игли.
• Подкожно въвеждане - със специална щипка опитният плъх се захваща за кожата на тила, с другата ръка се задържа краят на опашката и се опъва върху масата с гърба нагоре. Експериментаторът, взимайки със спринцовката от разтвора на оцветителя, със свободната си ръка опъва кожата на гърба, вкарва иглата под кожата и въвежда оцветителя.
• Интраперитонеално въвеждане - плъхът се фиксира с щипка и ръка, както при предишния опит, но се опъва надолу с главата. При това положение на тялото, коремните органи се преместват към диафрагмата, което позволява лекото проникване в коремната кухина без увреждането им. Иглата се въвежда в лявата долна половина на коремната стена под остър ъгъл.
• Венозно въвеждане - може да се направи в опашната или яремната вена, като предварително плъхът се връзва на специален станок, с корема нагоре. При сполучливо еднократно въвеждане, добро оцветяване настъпва след 24 часа, при вътрекоремното - след 48 часа. Подкожното въвеждане обикновено се повтаря няколко пъти през 3-4 дни. Настъпването на общо оцветяване лесно може да се определи по посиняването на слизестите обвивки и конюнктиви на очите. Цялостно посиняване на кожната покривка настъпва малко по-късно.

Лабораторната обработка на хистологичния материал става, след като животното се убие, отваря се и се вземат съответните органи и тъкани за изследване. Тя се състои от следните етапи:

• Фиксация - фиксацията на отложеното трипаново синьо в тъканите най-добре настъпва при използване на сложния фиксатор Буен.
• Поставяне в алкохоли - след фиксация материалът се поставя в 70-80 градусов алкохол, който се сменя няколко пъти. Подобни препарати могат да се приготвят и наблюдават микроскопски от срези, получени на замразяващ микротом.
• Включване в парафин
• Нарязване на микротом - приготвят се срези с дебелина 5-7 микрона.
• Оцветяване - при използване на трипаново синьо - с кармин или неутрално червено, при използване на литиев кармин - с метиленово синьо. След това се обезводняват, просветляват и включват в балсам.