Хистохимично изследване

Хистохимията-химията в контекста на биологичната тъкан - е безценен набор от техники, използвани за визуализиране на биологичните структури. Това поле се намира в интерфейса на органичната химия, биохимията и биологията. Интегрирането на тези дисциплини през миналия век позволява изобразяването на клетки и тъкани с помощта на микроскопия. Днес, като се използват уникалните химични среди в клетките, техниките на хетероложната експресия и ензимната активност, могат да се използват хистохимични методи за визуализиране на структури в живата материя.

Целта на хистохимията е да осигури цвят и контраст на микроскопичните изображения. Полето използва различни техники за изпълнение на специфичното етикетиране на биологичните структури. Хистохимиците провокират използването на клетъчни петна с малки молекули, маркирани молекули като антитела и ензимно-медиирано детектиране и усилване на сигнала. Исторически обаче, хистохимията е синоним на изобразяването на фиксирани (тоест мъртви) клетки и тъкани. Появата на техниките за генетична манипулация значително разширява хистохимичните методи към живите клетки.

Хистохимичните методи се използват широко при морфологичните изследвания и диагностика. Чрез тях на вътреклетъчно, клетъчно и тъканно ниво се проследяват химичните процеси и промените, настъпващи по време на жизнения цикъл в организма. Особено голямо е значението на хистохимично изследване при диагностика на туморите на стомашно-чревния тракт, кожата, белите дробове, бъбреците, матката и други.

Най-съвременните хистохимични методи за изследване, използвани с успех през последните години в онкологията, са имунохистохимичните. С помощта на тези методи се осъществява не само имунологичното типизиране на различните тумори, но се прави и диференциална диагноза на тумори от различни хистогенетични типове, изявяване на метастази в лимфни възли и костен мозък и други. По този начин се спомага за решаване на тъканната и органична принадлежност и евентуална прогноза за заболяването.

Имунохистохимичните изследвания се основават на концепцията, съгласно която неопластичните клетки експресират програма за диференциация, сходна с диференцировъчната програма на предполагаемия хистогенетиен източник на тумора. Имунохистохимичното изследване чрез епителни, мезенхимни, лимфоцитни и други маркери може да подпомогне изявяването и точната характеристика в тъканните срези на клетки от ниско диференцирани тумори или техни метастази.

С помощта на моноклонални антитела към белтъците на междинните епителни, мезенхимни или лимфоидни продукти, които се подчиняват на определени правила, отразяващи типа и състоянието на диференциация на съответните клетки, може с голяма вероятност да се докаже видовата принадлежност на туморните клетки, особено в случаите, когато не е възможно на светлинен микроскоп или със стандартните хистохимични методи.

По принцип всички хистохимични изследвания могат да се извършват върху различен хистологичен материал:

• трупен
• животински
• следоперационен
• отпечатъци
• намазки
• тъканни култури

Изискванията при вземане на материал за изследване са:

• максимална бързо вземане
• да бъде достатъчно по количество и с размери не по-малко от 0.5 кубични сантиметра
• тъканта да не се малтретира и рязането да става с остър нож
• необходимо е да има материал от различни участъци, с оглед сравняване на находките

За запазване прежизнената структура на тъкани и клетки и съдържанието на химични вещества в тях е необходимо материалът да бъди фиксиран. Фиксаторът преустановява протичането на химичните реакции в клетките и тъканите след отделянето им от организма, предотвратява автолизата и разпада под влияние на фактори от околната среда.

Изборът на фиксатор се определя от целта на изследването, вида на материала, химичните свойства на изучаваните вещества и времето, с което разполага патологът. Използват се същите фиксатори както при хистологично изследване.

Като метод за фиксация се използва и замразяване на срезите - свежи или фиксирани на формалинови пари тъкани. За направа на хистологични срези се използват замразяващ микротом или криостат. Основните групи вещества и техните продукти, които могат да бъдат доказани чрез методите на хистохимичния анализ, са въглехидрати, липиди, белтъци ферменти и други.

По-долу са дадени методите за оцветяване, използвани при хистохимично изследване:

• Киселинна фосфатазна реакция - тази хистохимична техника се използва за разпознаване на лизозомите, дължащи се на съдържанието на киселинна фосфатаза. Секциите се инкубират в разтвор, съдържащ оловен фосфат. Фосфатът се освобождава чрез ензимна активност на киселата фосфатаза (лизозомен ензим) и се утаява като оловен фосфат и след това се превръща в оловен сулфид - черен депозит.
• Алкална фосфатаза - хистохимичната техника, използвана за доказване на ензима, алкална фосфатаза, потъмнява клетките и тъканите, съдържащи ензима. Като цяло, степента на чернотата се корелира с наличното количество ензим. Точното локализиране се усложнява от факта, че ензимът може да промени своето вътрешноклетъчно положение по време на хистологичната процедура. Секциите се инкубират в разтвор, състоящ се от натриев глицерофосфат и калциев нитрат. Чрез действието на фосфатазата калциевият фосфат се утаява в тези региони, където е налице ензимът. За визуализация в секции калциевият фосфат се превръща в кобалтов фосфат и накрая в кобалтов сулфид, който е черен.
• Азокармин - ядрата са тъмночервени, а цитоплазмата е бледо червена.
• Azure II - Еозин: ядрото е синьо или лилаво. Базофилен материал син. Ацидофилен материал червен. Червените кръвни телца са оранжеви.
• Берлинско синьо (пруско синьо) - неразтворимо частици желязо-цианидно съединение, което се използва за инжектиране на кръвни и лимфни съдове.
• Кармин - специфично оцветяване за гликоген, чрез което гликогенните гранули се оцветяват в червено. PAS (периодична киселинна реакция на Шиф) също оцветява гликогенно червено и се използва по-често.
• Сребърен метод на Bielschowsky - ретикуларните фибрили на съединителната тъкан са черни. Всички други структури, жълти или кафяви. Метод на импрегниране, който зависи от намаляването от формалин на лесно редуцируемата сребърна сол, сребърен амониев хидроксид.
• Метод Bodian Silver - металичното сребро се утаява чрез действието на редуциращ агент (или екзогенен или ендогенен). Екзогенното средство води до натрупвания върху ретикуларни влакна и части от сборния комплекс (аргирофилия). Ендогенното средство води до утаяване на гранули от ентероендокринни клетки (реакцията на артаентафин).
• Cajal's Silver Stain (Cajal) - неврофибрили, аксони и дендрити черни. Други части кафяви. Общият принцип на Cajal методите (и има много модификации) е приложението на фотографски разработчици към тъкани, които са били третирани със сребърен нитрат.
• Хроматографски хематоксилин и флоксин - използването на тези багрила за диференциално оцветяване на алфа и бета клетки на островите на Langerhans е описано от Gomori, 1941 година. Гранулите на бета клетките са оцветени в тъмно синьо, а тези на алфа са розови или червени.
• Cresyl violet - основно багрило.
• Foots Silver - това е модификация на сребърния метод на Bielschowsky. Тънките колагенни или ретикуларни влакна оцветяват черно, други тъкани остават бледи. Азокарминът често се използва като противоположно оцветяване за оцветяване на клетките и за колагенно червено тъкан.
• Giemsa - еозинат от метиленово синьо, азот В еозинат, лазурен еозинат, метилен синьо-хлорид в метанол.
• Golgi - на повърхността на нервните клетки и клетките на невроглиазата се полага чернен оттенък на намалено сребро, така че формата на клетъчното тяло и неговите процеси да заемат видно място в почти безцветен фон. Тук и там се избират само единични клетки. Методът се състои основно от потапяне на пресни парчета нервна тъкан първо в разтвор на калиев дихромат (и обикновено и на осмова киселина) и след това в сребърен нитрат.
• Хематоксилин и еозин - хематоксилинът не е истинско основно багрило. Използва се с посредник, който разпознава компонентите на анионната тъкан. Хематоксилинът е почти специфично оцветяване на хроматина и затова се нарича "основно" петно. То оцветява ядрената мрежа, хромозомите в синьо. Това е регресивно петно и се екстрахира с много разредена киселина или киселинен алкохол. Може да се използва след почти всеки фиксатор и е постоянно петно. Еозинът е червено общо цитоплазмено петно. Той се комбинира с хемоглобин, за да даде оранжев цвят. Това е киселинна боя и термините ацидофилна, оксифилна и еозинофилна често се използват взаимозаменяемо. Той може да се използва след фиксиране и се използва като противоположно оцветяване в много комбинации в допълнение към хематоксилин.