Фазовоконтрастна микроскопия

Фазовоконтрастната микроскопия, описана за пръв път през 1934 година от холандския физик Frits Zernike, е оптична техника за повишаване на контраста, която може да се използва за създаване на висококонтрастни изображения на прозрачни проби, като живи клетки (обикновено в култура), микроорганизми, литографски модели, влакна, латексни дисперсии, стъклени фрагменти и субклетъчни частици (включително ядра и други органели).

Всъщност, техниката на фазовоконтрастна микроскопия използва оптичен механизъм за преобразуване на минутните вариации във фаза в съответни промени в амплитудата, които могат да бъдат визуализирани като разлики в контраста на изображението. Едно от основните предимства на микроскопията с фазов контраст е, че живите клетки могат да бъдат изследвани в тяхното естествено състояние, без преди това да бъдат убивани, фиксирани и оцветени. В резултат на това динамиката на протичащите биологични процеси може да бъде наблюдавана и записана във висок контраст с остра яснота на детайлите на минута проба.

Когато светлинните вълни преминават през среда, различна от вакуума, взаимодействието със средата води до промяна на амплитудата и фазата на вълната по начин, зависим от свойствата на средата. Промените в амплитудата (яркостта) възникват от разсейването и абсорбцията на светлина, която често зависи от дължината на вълната и може да доведе до цветове. Фотографското оборудване и човешкото око са чувствителни само към измененията на амплитудата. Без специални договорености фазовите промени са невидими. Фазовите промени обаче често носят важна информация.

Микроскопията с фазов контраст е особено важна в биологията. Той разкрива много клетъчни структури, които не се виждат с по- прост микроскоп на ярко поле. Тези структури стават видими за по-ранните микроскописти чрез оцветяване, но това изисква допълнителна подготовка и убива клетките. Микроскопът с фазов контраст е дал възможност биолозите да изучават живи клетки и как те се размножават чрез клетъчното делене.

Основният принцип за извършване на фазовите промени, които се виждат при фазовоконтрастна микроскопия, е да се отдели осветяващата (фоновата) светлина от светлината, разсеяна върху пробата (която съставлява подробностите на преден план), и да се манипулира по различен начин.

На изображението е представена схематична илюстрация на фазов контраст. Частично съгласуваното осветление, произведено от волфрамово-халогенната лампа, се насочва през колекторната леща и се фокусира върху специализиран пръстен (означен с херметичен алуминий), разположен в предната фокална равнина на кондензатора. Вълните, минаващи през пръстена, осветяват образеца или преминават през невидирани, или се разпръскват и забавят във фаза чрез структури и фазови градиенти, присъстващи в образеца. Неизлъчената и дифракционна светлина, събрана от обектива, се отделя в задната фокална равнина чрез фазова плака и се фокусира върху равнината на междинното изображение, за да се образува финалното контрастно изображение на фаза, наблюдавано в окулярите.

Преди изобретяването на техниките за фазово контрастиране, предаденото осветление на светлинно поле е един от най-често използваните режими на наблюдение в оптичната микроскопия, особено за фиксирани оцветени образци или други видове проби, които имат висока естествена абсорбция на видима светлина. Колективно, образците, които лесно се изобразяват с осветление на светлинно поле, се наричат обекти на амплитуда (или екземпляри), защото амплитудата или интензивността на светещите вълни се намалява, когато светлината преминава през пробата.

Добавянето на оптични принадлежности за фазов контраст към стандартен микроскоп на ярко поле може да се използва като техника за постигане на ефект на усилване на контраста в прозрачни образци, които напомнят на оптичното оцветяване. Светлинните вълни, които се разпръскват и се преместват във фаза от образеца (наречен фазов обект), могат да се трансформират чрез фазов контраст в амплитудни разлики, които се наблюдават в окулярите. Големи, удължени образци също лесно се визуализират с оптични фазови контрасти, дължащи се на явления на дифракция и разсейване, които се появяват по краищата на тези обекти. Ефективността на съвременните фазови контрастни микроскопи е толкова изтънчена, че позволява на проби, съдържащи много малки вътрешни структури или дори само няколко белтъчни молекули, да бъдат открити, когато технологията е свързана с електронно подобрение и обработка на изображения след получаване.

Пръстеновидната светеща светлина (зелена), която преминава през алуминия на кондензатора, е фокусирана върху образеца от кондензатора. Част от светещата светлина се разсейва от образеца (жълт цвят). Останалата светлина не се влияе от образеца и образува фоновата светлина (червена). При наблюдаване на биологичен образец разсеяната светлина е слаба и обикновено се премества фазово с -90° (поради типичната дебелина на пробите, така и разликата в индекса на пречупване между биологичната тъкан и околната среда) спрямо фоновата светлина. Това води до преден план (син вектор) и фон (червен вектор), които имат почти същата интензивност, което води до нисък контраст на изображението.

При фазовоконтрастна микроскопия контрастът на изображението се увеличава по два начина:

• чрез генериране на конструктивна намеса между разсеяните и фоновите светлинни лъчи в областите на зрителното поле, които съдържат образеца
• чрез намаляване на количеството фонова светлина, достигаща равнината на изображението. Първо, фоновата светлина се премества фазово с -90°, като се предава през пръстен с фазова промяна, което отстранява фазовата разлика между фона и разсеяните светлинни лъчи

Когато светлината се фокусира върху равнината на изображението (където е поставена камера или окуляр), това фазово изместване причинява фоново и разсеяно светлинно лъчение, идващи от областите на зрителното поле, които съдържат пробата (т.е. преден план), за да се намесват конструктивно, което води до увеличаване на яркостта на тези области в сравнение с регионите, които не съдържат пробата. Накрая, фонът е намален ~ 70-90% от сив филтърен пръстен - този метод максимизира разсеяната светлина, генерирана от осветлението (т.е. фоновата) светлина, като същевременно се сведе до минимум количеството осветяваща светлина, достигаща равнината на изображението. Част от разсеяната светлина (която осветява цялата повърхност на филтъра) ще бъде фазово изместена и затъмнена от пръстените, но в много по-малка степен от фоновата светлина (която осветява само фазовите и сиви филтърни пръстени).

Гореизложеното описва отрицателен фазов контраст. В своята положителна форма фоновата светлина вместо това се премества фазово с + 90°. По този начин фоновата светлина ще бъде на 180° от фазата спрямо разсеяната светлина. След това разсеяната светлина ще бъде извадена от фоновата светлина, за да се образува образ с по-тъмен преден план и по-светъл фон.

Изображенията, получени чрез фазовоконтрастна микроскопия, са относително лесни за интерпретиране, когато образецът е тънък и разпределен равномерно върху субстрата (какъвто е случаят с живите клетки, отгледани в тъканна култура с един слой). Когато се изследват тънки проби с помощта на оптична контрастна фаза, която е традиционната форма, произведена от повечето производители, те изглеждат по-тъмни от околната среда, когато индексът на пречупване на образеца надвишава този на средата. Контрастните оптични фази диференциално усилват контраста в близост до краищата, обхващащи разширените проби, като например границата между клетъчната мембрана и хранителната среда, и генерират изображения с висок контраст, които могат да бъдат грубо интерпретирани като карти с плътност. Тъй като амплитудата и интензитетът на изображението на образеца при фазов контраст е свързан с индекса на пречупване и дължината на оптичния път, плътността на изображението може да се използва като габарит за приближаване на взаимовръзките между различните структури. Всъщност, поредица от вътрешни клетъчни органели с увеличаваща се плътност, като вакуоли, цитоплазма, интерфазното ядро и ядрото (или митотичните хромозоми), обикновено се визуализират като постепенно по-тъмни обекти спрямо фиксирана референция, като фон.

Трябва също да се отбележи, че множество оптични артефакти присъстват във всички фазови контрастни изображения, а големите разширени екземпляри често показват значителни колебания в контраста и интензитета на изображението. Симетрията може също да бъде важен фактор при определянето на начина, по който се появяват големи и малки образци с фазов контраст.

Разумното тълкуване на изображения с фазов контраст изисква внимателно разглеждане и проверка, за да се гарантира, че артефактите не са неправилно присвоени на важни структурни характеристики. Например, някои вътрешни клетъчни органели и компоненти често имат по-нисък индекс на пречупване, отколкото този на заобикалящата цитоплазма, докато други имат по-висок индекс на пречупване. Поради различните индекси на пречупване, проявявани от тези многобройни вътреклетъчни структури, вътрешността на живите клетки, когато се гледа в положителен фазов контрастен микроскоп, може да разкрие набор от интензитети, вариращи от много ярки до изключително тъмни.

Например пиноцитозни везикули, липидни капчици и въздушни вакуоли, присъстващи в растенията и единични клетъчни протозои, имат по-нисък индекс на пречупване от цитоплазмата и по този начин изглеждат по-ярки от другите компоненти. За разлика от това, както беше обсъдено по-горе, органелите с високи показатели на пречупване (ядра, рибозоми, митохондрии и ядро) изглеждат тъмни в микроскопа. Ако фазовото забавяне, въведено от образеца, е достатъчно голямо (фазово отместване на разсеяната вълна с приблизително половин дължина на вълната), намесата между разпръснатите вълни и съраунд вълните става конструктивна, което прави тези проби по-ярки от заобикалящия фон.

За да се избегне объркване по отношение на яркия и тъмния контраст при изображения с фазов контраст, разликите в оптичната пътека, възникващи в рамките на подготовката на пробата, трябва да бъдат внимателно обмислени. Както бе обсъдено по-горе, разликата в оптичната пътека се получава от продукта на индекса на пречупване и дебелината на пробата и е свързана с относителното фазово отместване между пробната и фоновата (дифракционна и съраунд) вълни. Невъзможно е да се прави разграничение между компонентите с висок и нисък индекс на пречупване в изображение на фазов контраст без информация, отнасяща се до относителната дебелина на компонентите. Например, малък образец с висок индекс на пречупване може да покаже еднакво различие на оптичната пътека с по-голям образец с по-нисък индекс на пречупване. Двата образеца ще имат приблизително същата интензивност, когато се разглеждат чрез оптична система с фазов контраст.

В много биологични експерименти условията, които предизвикват свиване или подуване на клетки или органели, могат да доведат до значителни контрастни вариации. Външната среда също може да бъде заменена с друга, която има или по-висок или по-нисък индекс на пречупване, за да генерира промени в контраста на образеца. В действителност ефектът върху контраста на изображението на вариациите на индекс на пречупване в заобикалящата среда представлява основата на техниката, известна като "рефрактометрия на потапяне".

Фазовият контраст е отличен метод за повишаване на контраста на тънки прозрачни проби без загуба на разделителна способност и се е доказал като ценен инструмент в изследването на динамичните събития в живите клетки. Преди въвеждането на оптични системи с фазов контраст, клетките и другите полупрозрачни проби се онагледяват в микроскопия с ярко поле, чрез изкуствени техники за оцветяване. Въпреки че тези образци могат да се наблюдават и записват с тъмно поле и наклонено осветление или чрез дефоскусиране на микроскоп от светло поле, тази методология се оказва ненадеждна при предоставянето на критична информация за клетъчната структура и функция.

Техниката на фазовоконтрастна микроскопия се прилага широко в биологичните и медицински изследвания, особено в областта на цитологията и хистологията. Като такава, методологията се използва за изследване на живи клетки, тъкани и микроорганизми, които са прозрачни при осветяване на светлинно поле. Контрастът на фазите дава възможност за лесно визуализиране на вътрешните клетъчни компоненти, като мембрана, ядра, митохондрии, митотични апарати, хромозоми и цитоплазмени гранули от растителни и животински клетки и тъкани. В допълнение, микроскопията с фазов контраст се използва широко при диагностицирането на туморни клетки и растежа, динамиката и поведението на голямо разнообразие от живи клетки в културата. Специални оптични системи с дълъг работен дистанционен фазов контраст са разработени за инвертирани микроскопи, използвани за изследване на тъканни култури. Други области в медицината, които се възползват от наблюдението на фазовия контраст, са хематологията, вирусологията, бактериологията, паразитологията, палеонтологията и морската биология.

Промишлените и химическите приложения за фазов контраст включват изследване на минералогията, кристалографията и полиморфизма. Безцветни микрокристали, прахове, твърди частици и кристални полимери, които имат индекс на пречупване, който се различава само леко от този на обкръжаващата течност за потапяне, често се наблюдават лесно чрез фазовоконтрастна микроскопия. Всъщност често се използва количествена рефрактометрия, за да се получат стойности на индекс на пречупване и за целите на идентификацията. Други търговски продукти, изследвани чрез оптични техники с фазово контраст, включват глини, мазнини, масла, сапуни, бои, пигменти, храни, наркотици, текстил и други влакна.