Спектрофотометрично изследване

В химията спектрофотометрията е количественото измерване на отражателните или предавателните свойства на материала като функция на дължината на вълната. Спектрофотометрията използва фотометри, известни като спектрофотометри, които измерват интензитета на светлинния лъч като функция от неговия цвят (дължина на вълната). Важните характеристики на спектрофотометрите са спектралната широчина на честотната лента (диапазонът от цветове, които може да предава чрез тестовата проба), процентът проба-предаване, логаритмичният диапазон на абсорбцията на пробата и понякога процент от измерването на отражение.

Спектрофотометър обикновено се използва за измерване на пропускливостта или отразяването на разтвори, прозрачни или непрозрачни твърди вещества, като полирано стъкло или газове. Въпреки че много биохимични вещества са оцветени, те абсорбират видима светлина и следователно могат да бъдат измерени чрез колориметрични процедури, дори безцветните биохимикали често могат да бъдат превърнати в оцветени съединения, подходящи за хромогенни реакции, образуващи цвят, за да се получат съединения, подходящи за колориметричен анализ. Въпреки това, те могат да бъдат проектирани така, че да измерват дифузивността на изброените диапазони на светлината, които обикновено покриват около 200-2500 нанометра, използвайки различни контроли и калибриране. В рамките на тези диапазони светлина са необходими калибрации на машината, като се използват стандарти, които варират в зависимост от дължината на вълната на фотометричното определяне.

Използването на спектрофотометрично изследване обхваща различни научни области като физиката, науката за материалите, химията, биохимията и молекулярната биология. Те се използват широко в много отрасли, включително полупроводници, лазерно и оптично производство, печатане и съдебно изпитване, както и в лаборатории за изследване на химични вещества. Спектрофотометрията често се използва в измерванията на ензимните активности, определянето на протеиновите концентрации, определянето на ензимните кинетични константи и измерванията на реакциите на свързване на лиганда. В крайна сметка, спектрофотометърът може да определи в зависимост от контрола или калибрирането какви вещества присъстват в целта и колко точно чрез изчисления на наблюдаваните дължини на вълните.

Спектрофотометричното изследване е от голямо клинично значение в почти всички клонове на медицината. Неговата способност да измерва концентрациите на метаболитно важни вещества в телесните течности, като кръв, цереброспинална течност, урина и амниотична течност, е от решаващо значение за правилните диагностични находки и непрекъснатото наблюдение на пациентите. Също рано идентифицираните малки недостатъци на някои съществени вещества могат да помогнат за предотвратяване на свързани здравословни проблеми.

В интензивната медицина използването на спектрофотометрични анализи е по-честа, поради факта, че пациентите в нестабилни състояния са по-податливи на драстични промени в количеството на различни вещества, например в кръвта им. По този начин интензивните отделения често разполагат със спектрофотометри на място, докато общопрактикуващите лекари могат да изпращат своите сонди за анализ в лаборатория.

Веществата, които могат да бъдат анализирани количествено чрез спектрофотометри, са многобройни. Те включват: хемоглобин, еритроцити, хематокрит, амилаза, билирубин, холестерол, глюкоза, урея, креатинин, липаза, триглицерид, албумин, алкохол, амоняк, мед, магнезий, лактат, калций, желязо, магнезий, алуминий, натриев карбонат, въглероден окис и дори някои ензими.

Има два основни класа спектрофотометри:

• с единичен лъч
• с двоен лъч

Двойният спектрофотометър сравнява интензитета на светлината между два светлинни пътеки, един път съдържащ референтна проба, а другият - пробата за изпитване. Един спектрофотометър с единичен лъч измерва относителния интензитет на светлината на снопа преди и след поставянето на пробата за изпитване. Макар че сравняващите измервания от двойни светлинни инструменти са по- лесни и по-стабилни, еднолъчевия може да има по-голям динамичен диапазон и е оптически по-прост и по-компактен. Освен това някои специализирани инструменти, като спектрофотометри, вградени върху микроскопи или телескопи, са инструменти с един лъч поради практичност.

В исторически план спектрофотометрите използват монохроматор, съдържащ дифракционна решетка, за да се получи аналитичният спектър. Решетката може да бъде подвижна или фиксирана. Ако се използва един детектор, като тръба за фокусиране или фотодиод, решетката може да бъде сканирана по стъпка, така че детекторът да може да измерва интензитета на светлината при всяка дължина на вълната (което съответства на всяка "стъпка"). Могат да се използват и масиви от детектори, като устройства с обвързано зарядно или фотодиодови решетки. При такива системи решетката е фиксирана и интензивността на всяка дължина на вълната на светлината се измерва с различен детектор в масива. Освен това, повечето съвременни средно инфрачервени спектрофотометри използват преобразуваща техника на Фурие, за да придобият спектралната информация. Техниката се нарича инфрачервена спектроскопия на Фурие.

При извършване на предавателни измервания спектрофотометърът сравнява количествено фракцията на светлината, която преминава през еталонен разтвор и тестван разтвор, след което електронизира сравнението на интензитетите на двата сигнала и изчислява процента на предаване на пробата в сравнение с еталонния стандарт. За измерванията на отражателната способност спектрофотометърът сравнява количествено фракцията на светлината, която се отразява от еталонните и изпитваните проби. Светлината от изходната лампа се прекарва през монохроматор, който дифрактира светлината в "дъга" с дължина на вълната през въртяща се призма и извежда тесните честотни ленти на този дифракционен спектър през механичен процеп на изходната страна на монохроматора. Тези честотни ленти се предават през пробата. Тогава плътността на потока от фотонни елементи (обикновено на квадратни ватове на квадратен метър) на предаваната или отразена светлина се измерва с фотодиод, устройство, свързано със заряд или друг сензор за светлина. След това стойността на пропускливостта или отражението за всяка дължина на вълната на изпитваната проба се сравнява със стойностите на предаване или отражение от референтната проба. Повечето спектрофотометри прилагат логаритмична функция към коефициента на линейна пропускливост, за да изчислят "абсорбцията" на пробата, стойност, която е пропорционална на "концентрацията" на химичното вещество, което се измерва.

Накратко, последователността на събитията в съвременния спектрофотометър е както следва:

• Източникът на светлина блести в монохроматор, разпръсва се в дъга и се разделя на два лъча. След това се сканира през пробата и референтните разтвори.
• Фракции на дължините на вълните на вълните се предават чрез или отразяват от пробата
• Получената светлина удари устройството за фотодетектори, което сравнява относителния интензитет на двата лъча светлина.
• Електронните схеми преобразуват относителните токове в проценти на линейно предаване и/или стойности на абсорбция/концентрация.

За развитието на спектофотометрично изследване съществено значение изиграват постиженията на фотоелектричните ефекти в микроскопските ефекти и в спектралната химия. Благоприятен ефект оказват и откритията на специфичните оцветители, свързващи се със строго определени биологични структури. По-късно в практиката навлизат други оцветители за хистони, за аминокиселини и протеини. В практиката навлизат и флуоресциращи вещества като етидиум бромид, пропидиум бромид и други. Тези оцветители и реакции позволяват развитието на:

• абсорбционна цитофотометрия
• сканираща цитофотометрия
• флуоресцентна цитофотометрия
• поточна цитофотометрия

Абсорбционната цитофотометрия използва цитохимичните реакции на клетката с багрилните продукти. Тя е основана на принципа на абсорбцията на част от светлината, която преминава през клетката или течната среда. Светлинният сноп на вълната е с дължина на вълната във видимия спектър. Следователно абсорбиращата светлина и тази, която преминава през обекта, ще зависи от неговата оптична плътност, тоест ще зависи от концентрацията на изследваното вещество. Полученият резултат, отразяващ количеството субстанция, се отбелязва в работни единици. Нанасянето им става на хистограма, чиято основа е координатната система.

При абсорбционната цитофотометрия се работи с рутинни хистологични или цитологични препарати, оцветени по метода на Фьолген. Измерването на оптичната плътност може да се извърши по няколко начина, в зависимост от вида на препарата. От значение са гъстотата на клетките, тяхната форма и размери, интензитетът им на оцветяване, както и оцветителния фон. Признати са следните начини на изследване:

• измерване на целия обект - използва се при еднакви по форма и размери ядра
• запушалков начин - предпочита се предимно при хистологични срези
• многозапушалков начин - при него се измерва повече от една зона в ядрото с помощта на малка по размер бленда
• двуплощно едно вълнов начин - използва принципа на запушалковия начин
• двойно вълнов начин - едни от най-трудоемките начини

Сканиращата цитофотометрия се основава на запушалковия начин на изследване, като се фотометрират системно голям брой точки от цялото ядро. Получава се по-богата информация - оптична и геометрична. Получава се информация за промените в хроматинната структура на ядрата, при различни функционални и патологични състояния на клетката. Разпределението на хроматина в ядрото за определени видове е постоянна величина. Всяко повишение или намаление на клетъчните функции ще се отрази и на нивото на двата хроматина.

В основата на флуоресцентната цитофотометрия лежи реакцията на свързване на известен флуорохром с определена клетъчна структура. Отделената светлина от флуоресциращия обект е с различна дължина на вълната от тази, възбудила флуоресценцията. Но и тук е необходим еталон. В единия участък на изследвания препарат се нанасят еталонни клетки, с познати ДНК-стойности.

При поточната цитофотометрия се работи със свеж или замразен материал. И при този метод се използват флуорохроми. Но за разлика от останалите методи, при този се използва материал във вид на клетъчна суспензия. Всяка клетка минава през оптичния фокус на апарата. Нейната флуоресценция се трансформира в електрически сигнал. Всички сигнали се подреждат в строго определени канали според силата на флуоресценцията. Резултатите се записват на хистограма.